基因编辑新款“瑞士军刀”问世，小巧又好用！
出(chū)(chū)品(pǐn)(pǐn)：
作(zuò)(zuò)者(zhě)(zhě)：龚(gōng)(gōng)路遥(yáo)(yáo)（中(zhōng)(zhōng)国(guó)(guó)科(kē)(kē)学(xué)(xué)院(yuàn)(yuàn)微(wēi)(wēi)生(shēng)(shēng)物(wù)(wù)研(yán)(yán)究(jiū)(jiū)所(suǒ)(suǒ)）
监(jiān)(jiān)制(zhì)(zhì)：中(zhōng)(zhōng)国(guó)(guó)科(kē)(kē)普(pǔ)(pǔ)博(bó)(bó)览(lǎn)(lǎn)
编(biān)(biān)者(zhě)(zhě)按(àn)(àn)：为(wèi)(wèi)揭(jiē)开(kāi)科技工作的神秘(mì)面(miàn)纱(shā)，前沿科技项目推出“我和我的研究”系列文章，邀请科学家亲自执笔，分享科研历程，打造科学世界。让我们跟随站在科技最前沿的探索者们，开启一段段充满热情、挑战与惊喜的旅程。
去年8月23日，我们团队——中国科学院微生物研究所向华团队，在国际期刊《自然·通讯》（Nature Communications）杂志上发表了题为《工程化最小I型 CRISPR-Cas 实现人类细胞的转录激活和碱基编辑》的最新研究成果，成功应用Class 1中最精简的I-F2型系统，在人类细胞中实现了高效基因调控，并开发了具有宽编辑窗口的碱基编辑工具。
论文DOI: 10.1038/s41467-024-51695-x
怎样理解这款基因编辑的新工具呢？它又将如何改变我们的生活？
基因编辑技术，就像一把“基因魔剪”
基因编辑作为近年来发展迅猛的颠覆性技术，具有广阔的(de)应(yīng)用(yòng)前(qián)景(jǐng)，如(rú)修(xiū)复(fù)遗(yí)传(chuán)疾(jí)病(bìng)的(de)突(tū)变(biàn)基(jī)因(yīn)、提(tí)高(gāo)农(nóng)作(zuò)物(wù)的(de)产(chǎn)量(liàng)和(hé)抗(kàng)旱(hàn)性(xìng)等(děng)。
基(jī)因(yīn)编(biān)辑(ji)技(jì)术(shù)是(shì)指(zhǐ)对(duì)生(shēng)命(mìng)遗(yí)传(chuán)物(wù)质（DNA）进行精确改造的技术。简单来说，它就像是给DNA做“剪切粘贴”的工具。
DNA是生物体内携带遗传信息的分子，它决定了生物的各种特征，比如眼睛的颜色、身高，甚至是某些疾病的易感性。想象一下，DNA就像是一本说明书，里面写着如何构建一个生物体的所有指令。基因编辑技术就是让我们能够阅读这本说明书，并且对其中的内容进行修改。
具体来说，基因编辑技术允许科学家们定位到DNA上的特定位置，然后进行精确的切割，就像是用剪刀剪掉说明书上的某一句话。接着，科学家们可以替换掉被剪掉的部分，或者添加一些新的内容，这就像是用胶水把新的句子粘到说明书上。
通过对指定的突变基因进行修复、对有害基因进行清除或对有益基因进行强化等，DNA的指令得到了修改，生物也从而获(huò)得(de)了(le)新的功能或表型。
最流行的“分子剪刀”，也并非完美
目前，最流行的基因编辑技术叫做CRISPR-Cas9，它就像是一把非常锋利的“分子剪刀”，可以快速、高效地对DNA进行编辑。
那么，CRISPR-Cas9为什么能够起到“分子剪刀”的作用呢？
CRISPR-Cas系统是(shì)广(guǎng)泛(fàn)存(cún)在(zài)于(yú)细(xì)菌(jūn)和(hé)古(gǔ)菌(jūn)中(zhōng)的(de)免(miǎn)疫(yì)系(xì)统(tǒng)，就(jiù)像(xiàng)是(shì)它(tā)们(men)身(shēn)体(tǐ)里(lǐ)的(de)“警(jǐng)察(chá)”，能(néng)够(gòu)识(shi)别(bié)并(bìng)“抓(zhuā)住(zhù)”那(nà)些(xiē)想(xiǎng)要(yào)伤(shāng)害(hài)它(tā)们(men)的(de)病(bìng)毒(dú)。
而(ér)CRISPR-Cas9就(jiù)像(xiàng)是(shì)这(zhè)个(gè)(gè)免(miǎn)(miǎn)疫(yì)(yì)系(xì)(xì)统(tǒng)中(zhōng)的(de)一(yī)个(gè)特(tè)别(bié)厉(lì)害(hài)的(de)“警(jǐng)察(chá)”。它(tā)由(yóu)两(liǎng)部(bù)分(fēn)组(zǔ)成(chéng)：一个是“向导”（引导RNA），另一个是“剪刀”（Cas9蛋白）。当病毒试图入侵细菌时，“向导”会先找到病毒的DNA（就像是病毒的“身份证”），然后“剪刀”就会剪断病毒的DNA，使病毒无法正常工作。
科学家们发现这个“警察”非常厉害，于是他们就利用这个原理，开发出了一种叫做CRISPR-Cas9的(de)工(gōng)具(jù)，用(yòng)来(lái)编(biān)辑(ji)其(qí)他(tā)生(shēng)物(wù)的(de)基(jī)因(yīn)。
首(shǒu)先(xiān)，科(kē)学(xué)家(jiā)们(men)会(huì)设(shè)计(jì)一(yī)个(gè)“向(xiàng)导(dǎo)”，这(zhè)个“向导”可以精确地找到我们想要编辑的DNA序列。然后，再使用“剪刀手”在那个位置上剪断DNA。接下来，细胞会尝试修复这个断裂的地方，而科学家们可以利用这个机会，把他们想要的基因片段添加进去，或者修改现有的基因。
基因编辑技术
（图片来源：veer图库）
CRISPR-Cas系(xì)统(tǒng)具(jù)有(yǒu)高(gāo)效(xiào)、特(tè)异(yì)、设(shè)计(jì)简(jiǎn)单(dān)等(děng)显(xiǎn)著(zhe)优(yōu)势(shì)，目(mù)前(qián)已(yǐ)被(bèi)广(guǎng)泛(fàn)应(yīng)用(yòng)于(yú)从细菌至哺乳动物等多种生物的基因编辑。
然而，即便是像CRISPR-Cas9工具这样流行的“分子剪刀”，也并非是完美的。传统的CRISPR-Cas系统在编辑过(guò)程(chéng)中(zhōng)会(huì)切(qiè)割(gē)靶(bǎ)标(biāo)DNA双(shuāng)链(liàn)，可(kě)能(néng)引(yǐn)起(qǐ)细(xì)胞(bāo)损(sǔn)伤(shāng)等(děng)风(fēng)险(xiǎn)。
碱(jiǎn)基(jī)编(biān)辑(ji)技(jì)术(shù)：“剪(jiǎn)刀”升级为“可(kě)擦(cā)(cā)笔(bǐ)(bǐ)”
为(wèi)改(gǎi)进(jìn)这(zhè)一(yī)缺(quē)点(diǎn)，在(zài)传(chuán)统(tǒng)的(de)CRISPR-Cas系(xì)统(tǒng)基(jī)础(chǔ)上(shàng)，衍(yǎn)生(shēng)出(chū)了(le)一(yī)种(zhǒng)重(zhòng)要(yào)的(de)碱(jiǎn)基(jī)编(biān)辑(ji)技(jì)术(shù)。
碱(jiǎn)基(jī)编(biān)辑(ji)(ji)技(jì)(jì)术(shù)(shù)就(jiù)(jiù)像(xiàng)(xiàng)是(shì)(shì)一(yī)(yī)支(zhī)(zhī)特(tè)(tè)殊(shū)(shū)的(de)(de)笔(bǐ)(bǐ)，它(tā)(tā)结(jié)(jié)合(hé)(hé)了(le)(le)切(qiè)割(gē)功(gōng)能(néng)受(shòu)损(sǔn)的(de)CRISPR-Cas和(hé)一(yī)种(zhǒng)叫(jiào)做(zuò)脱(tuō)氨(ān)酶(méi)的(de)“墨(mò)水(shuǐ)”。当(dāng)“向(xiàng)导(dǎo)”找(zhǎo)到(dào)需(xū)要(yào)修(xiū)改(gǎi)的(de)DNA位(wèi)置(zhì)时(shí)，神(shén)奇(qí)的(de)“墨(mò)水(shuǐ)”可(kě)以(yǐ)直(zhí)接(jiē)把(bǎ)那(nà)个位置的字母改成我们想要的字母，从而避免了剪断DNA双链可能会造成的损伤。
但是，这种特殊的笔也有它的限制。比如，它只能在一定范围内修改字母，这个范围就是“编辑窗口”。目前，科学家们正在努力让这支笔进化得更小巧、更精确，并且能够修改不同范围的字母。
此外，就像不同的纸可能需要不同的笔来书写一样，单一的基因编辑工具难以在不同的生物中发挥功能。科学家们也正致力于发现更多CRISPR-Cas类型(xíng)，为(wèi)多(duō)样(yàng)化(huà)的基因编辑工具开发提供支持。
这也是我们团队（中国科学院微生物研究所向华团队）一直努力的方向。
新款基因编辑“瑞士军刀”问世
如前文所说，在细菌的免疫系(xì)统(tǒng)中(zhōng)，CRISPR-Cas系(xì)统(tǒng)种(zhǒng)类(lèi)多(duō)样(yàng)，不(bù)只(zhǐ)有(yǒu)CRISPR-Cas9这(zhè)一(yī)个(gè)“警(jǐng)察(chá)”。
其(qí)中(zhōng)，I型(xíng)CRISPR-Cas系(xì)统(tǒng)可(kě)以(yǐ)组(zǔ)合(hé)多(duō)种(zhǒng)Cas蛋(dàn)白(bái)(bái)形(xíng)(xíng)成(chéng)(chéng)复(fù)(fù)合(hé)物(wù)（Cascade）。Cascade可(kě)以(yǐ)与(yǔ)不(bù)同(tóng)的(de)功(gōng)能(néng)元(yuán)件(jiàn)组(zǔ)装(zhuāng)，开(kāi)发(fā)不(bù)同(tóng)的(de)衍(yǎn)生(shēng)工(gōng)具(jù)。基(jī)于(yú)这(zhè)一(yī)系(xì)统(tǒng)开(kāi)发(fā)的(de)遗(yí)传(chuán)工(gōng)具(jù)，在(zài)细(xì)菌(jūn)和(hé)古(gǔ)菌(jūn)中(zhōng)表(biǎo)现(xiàn)出(chū)高(gāo)效(xiào)性与适应性，但(dàn)较(jiào)大(dà)的(de)基(jī)因(yīn)尺(chǐ)寸(cùn)却(què)不(bù)利(lì)于(yú)工(gōng)具(jù)的(de)递(dì)送(sòng)，限(xiàn)制(zhì)了(le)其(qí)在(zài)哺(bǔ)乳(rǔ)动(dòng)物(wù)细(xì)胞(bāo)中(zhōng)的(de)应(yīng)用(yòng)。
因(yīn)此(cǐ)，我(wǒ)们(men)团(tuán)队(duì)近(jìn)年(nián)来(lái)将(jiāng)目(mù)光(guāng)聚(jù)焦(jiāo)到(dào)了(le)I-F2型(xíng)系(xì)统(tǒng)上(shàng)，它(tā)具有最精简、基因尺寸最小的Cascade。但在此前，科学家一直未能在哺乳动物细胞中检测到它(tā)的(de)活(huó)性(xìng)。这(zhè)也(yě)为(wèi)我(wǒ)们(men)团(tuán)队(duì)的(de)研(yán)发(fā)带(dài)来(lái)了(le)挑(tiāo)战(zhàn)。
通(tōng)过(guò)生(shēng)物(wù)信(xìn)(xìn)息(xi)(xi)学(xué)(xué)分(fēn)(fēn)析(xī)，我(wǒ)们(men)团(tuán)队(duì)在(zài)数(shù)据(jù)库(kù)中(zhōng)找(zhǎo)到(dào)93个(gè)不(bù)同(tóng)菌(jūn)种(zhǒng)来(lái)源(yuán)的(de)I-F2型(xíng)CRISPR-Cas系(xì)统(tǒng)。这(zhè)极(jí)大地扩充了这类系统的基因资源，为其应用提供更多选择。其中，11个不同来源的I-F2型CRISPR-Cas系统被合成并在人类细胞中测试其功能。
最终，我们发现来自奥斯陆莫拉氏菌（Moraxella osloensis CCUG 350）的I-F2型系统在(zài)人(rén)类(lèi)细(xì)胞(bāo)中(zhōng)可(kě)以(yǐ)表(biǎo)现(xiàn)出(chū)较(jiào)好(hǎo)的(de)活(huó)性(xìng)。它(tā)的(de)Cascade仅(jǐn)由(yóu)3种(zhǒng)蛋(dàn)白(bái)组(zǔ)成(chéng)（Cas5-6-7），基(jī)因(yīn)大(dà)小(xiǎo)之(zhī)和(hé)约(yuē)2.7kb, 比(bǐ)目(mù)前(qián)应(yīng)用(yòng)最(zuì)广的SpCas9（约4.1kb）还要小。
我们通过将I-F2型系统融合不同的功能元件，在人类细胞中实现了不同的功能，它就(jiù)像(xiàng)一(yī)组(zǔ)“瑞(ruì)士(shì)军(jūn)刀”，虽然小巧，但非常好用：
1.多基因表达上调：在该系统的Cas7蛋白上融合转录激活因子VPR，我们获得了I-F2型转录激活工具（I-F2 CRISPRa），可实现多个基因的表达上调。这意味着，如果我们想让细胞多产生一些特定的蛋白质，可以用这个功能来实现。
2.靶标基因表达进一步提高：通过对引导RNA和Cas7的工程化改造，靶标基因的表达进一步提高，可以与SpCas9相当，甚至在某些位点效果更强。可以理解工具变得更加高效，可以产生更多特定的蛋白。
3.更宽的编辑窗口：在该系统的Cas5蛋白上融合表达腺嘌呤脱氨酶TadA-8e，我们获得了I-F2型腺嘌呤碱基编辑工具（I-F2 ABE），其编辑窗口覆盖约30个碱基（基于Cas9的碱基编辑工具窗口通常小于10个碱基），可以将编辑窗口内的腺嘌呤A变为鸟嘌呤G。I-F2 ABE产生的宽编辑窗口具有更多的可靶向位点，能诱导更多的突变类型。
I-F2型(xíng)底(dǐ)层(céng)平台构建新型转录激活及碱基编辑工具
（图片来源：作者自绘）
应用潜力巨(jù)大(dà)，有望开发更多新型工具
目前来看，这款新型的基因编辑工具，展示出了巨大(dà)的(de)潜(qián)力(lì)：
1.利(lì)于(yú)真(zhēn)核(hé)细(xì)胞(bāo)中(zhōng)递(dì)送(sòng)：这(zhè)项(xiàng)研(yán)究(jiū)突(tū)出(chū)了(le)精(jīng)简(jiǎn)的(de)(de)I-F2型(xíng)(xíng)系(xì)(xì)统(tǒng)在(zài)真(zhēn)核(hé)生(shēng)物(wù)中(zhōng)的(de)应(yīng)用(yòng)潜(qián)力(lì)，其(qí)小(xiǎo)型(xíng)化(huà)的(de)基因组成利于基因编辑工具的体内递送。
2.适用于作物育种与改良：宽窗口的碱基编辑工具适用于功能序列的破坏、作物育种中重要基因的原位饱和诱变与多重碱基编辑等。
3.新型底层平台：I-F2型系统Cascade的多蛋白组成，使其便于融合多个功能元件，为开发更多新颖的基因操作工具提供底层平台。
这项研究突出了精简的I型系统在真核生物中的应用潜力，尤其是具有宽编辑窗口的碱基编辑工具。未来，对该系统进行全面的工程化改造，还有望进一步提高其编辑效率或转录激活水平。
参(cān)考(kǎo)文献(xiàn)：
1.Pacesa, M., Pelea, O. & Jinek, M. Past, present, and future of CRISPR genome editing technologies. Cell 187, 1076-1100, doi:10.1016/j.cell.2024.01.042 (2024).
2.路遥 & 向华. 2020 年度诺贝尔化学奖: 源自微生物学前沿研究的重大突破. 科学通报 65, 4171-4176, doi:10.1360/TB-2020-1416 (2020).
3.Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A. & Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424, doi:10.1038/nature17946 (2016).
4.Makarova, K. S. et al. Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants. Nature Reviews Microbiology 18, 67-83, doi:10.1038/s41579-019-0299-x (2020).
5.Li, M. et al. Toxin-antitoxin RNA pairs safeguard CRISPR-Cas systems. Science 372, doi:10.1126/science.abe5601 (2021).
6.Xu, Z. et al. Native CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing Enables Dissecting and Sensitizing Clinical Multidrug-Resistant P. aeruginosa. Cell Reports 29, 1707-1717 e1703, doi:10.1016/j.celrep.2019.10.006 (2019).
7.Cheng, F. et al. Harnessing the native type I-B CRISPR-Cas for genome editing in a polyploid archaeon. Journal of Genetics and Genomics 44, 541-548, doi:10.1016/j.jgg.2017.09.010 (2017).
